宾夕法尼亚大学医学研究人员在《科学进展》(Science Advances)网站上发表的一项新的概念验证研究报告称，一项新的CRISPR基因编辑技术可预防已知由数百种不同突变驱动的遗传性肝病，并改善了小鼠的临床症状。这些发现表明了一种很有前途的CRISPR工具，它可以潜在地治疗一种罕见的代谢性尿素循环疾病，这种疾病是由缺乏鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)引起的，以及由同一基因的不同突变引发的其他遗传性疾病。

CRISPR方法是建立在宾夕法尼亚医学院之前开发的一种方法的基础上，该方法仅限于纠正一种突变——它对新生的小鼠有益，但对成年小鼠无效。这一次，这项技术使用了一种新型的双腺相关病毒载体(AAV)来传递其成分，将一种“迷你基因”插入到基因组中，以一种被称为“剪切”和“粘贴”的方法来实现OTC在肝细胞中的持续表达。没有突变被纠正，而是一组新的指令被添加到细胞中。结果，研究人员观察到新生小鼠的临床受益持续到成年。

“就像大多数对新生儿造成致命影响的遗传疾病一样，长期有效的早期治疗至关重要。”医学教授、宾夕法尼亚大学基因治疗项目和孤儿疾病中心主任、医学博士詹姆斯·威尔逊(James Wilson)说。“在此，我们提出了一种CRISPR方法，不仅可以在细胞中维持OTC的表达，还可以拓宽该工具的功能。我们的目标是最终将这种基因编辑方法从动物身上应用到治疗OTC疾病和其他基因疾病上，这些疾病是由分散在整个基因中的突变引起的，而不是单一的显性突变。”

在近四万分之一的新生儿中发现，OTC紊乱可能源于OTC基因的300多种不同突变。由于这些突变发生在X染色体上，通常在男性身上发现，而女性是携带者。尿素循环是一系列六种肝酶，帮助人体排出氨。当其中一种酶缺失或缺乏时，氨就会在血液中积聚并进入大脑，从而导致大脑损伤甚至死亡。为了治疗这种疾病，患者服用药物来刺激替代的氮清除途径，或者在严重的情况下，进行肝脏移植。然而，这些患者的死亡率仍然很高，因此需要更新、更有效的治疗方法。

为了开发一种广泛应用的基因组编辑工具，该团队构建了一个新的双AAV载体，其中包含一种被称为Cas9的RNA引导的细菌蛋白，这是一种快速、可靠的方法来发现和操作细胞中的基因。这种Penn开发的载体被称为AAV8，它特别与肝细胞有亲和力。第二个AAV包含一个功能完整的“迷你基因”，该基因表达一种编码优化的人类OTC (供体DNA)，由一种肝脏特异性启动子驱动，以确保它在注入血液时只在肝细胞中表达。

第一步是Cas9沿着基因的靶向位点在DNA中产生一个断裂(“剪切”)，这为在所谓的同源定向修复或HDR(“粘贴”)中添加迷你基因奠定了基础。

“与其它删除或修改部分正常基因的CRISPR方法不同，这项技术整合了新的部分。”第一作者、医学研究副教授Lili Wang博士说。“我们不是在试图纠正阻止肝细胞产生OTC的突变，我们是在添加这种新的迷你基因，这样细胞就可以产生OTC。” 

靶向载体处理的小鼠在3周和8周时肝脏中分别显示出25%和35%的OTC表达细胞，分别是非靶向载体处理小鼠的4倍和3倍。在这两个时间点上(3周和8周)，大多数OTC阳性的肝细胞分布在靶向小鼠肝脏的各个部位。

研究人员还观察到，与未服用高蛋白饮食的小鼠相比，服用高蛋白饮食的小鼠的氨水平降低了60%，这一临床迹象表明，肝细胞正在产生OTC。

“通过这些成功的动物研究，我们已经接近一种潜在的‘广谱’基因编辑方法来治疗OTC缺陷的患者，而不考虑突变和临床状态。”Wilson说，“下一步说通过更多的临床前研究，在人类肝细胞的基因上找到一个安全的避风港，然后测试类似的基因编辑方法。”

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